Úvod
Tyto materiály byly inovovány za podpory OPVK proejktu EnviMod (http://envimod.fzp.ujep.cz)
CZ.1.07/2.2.00/28.0205 „Modernizace výuky technických a přírodovědných oborů na UJEP se zaměřením na problematiku ochrany životního prostředí“ – ENVIMOD
Osnova témat
Organizace výuky
Požadavky na studenty, seminární práce, průběžný test, závěrečná zkouška
Téma 1 - Úvod do biotechnologií
To nejdůležitější
Biotechnologie je věda využívající biologický materiál (živý i mrtvý) pro technologické účely.
Biotechnologické produkce mohou být od gramů až po tisíce tun.
Tradičně se dělí podle barev, ale toto členění už je dnes přežité a ustupuje se od něj.
Otázky
Zamyslete se nad možnostmi a perspektivami použití různých organismů resp. biologického materiálu v ochraně životního prostředí.
Zamyslete se nad tím, které produkty běžného života, mají biotechnologický původ.
Téma 2 - Surovinová základna
To nejdůležitější
Obvykle se vychází z obnovitelných zdrojů.
Protichůdné požadavky na suroviny (dostupnost, stálost, koncentrace žádoucích látek, cena…).
Často se vychází z odpadních surovin.
Organismy potřebují vhodné zdroje biotických prvků – ty musí být v potravě resp. v živných médiích.
Do kultivačních médií pro mikroorganismy se často přidávají selektivní činidla pro potlačení kontaminujících mikroorganismů – pozitivní (forma živiny nebo podmínek vyhovující jen žádoucímu organismu) a negativní (látka nebo podmínky pro eliminaci nežádoucích mikroorganismů, např. antibiotika).
Živná média pro mikroorganismy se sterilují, to ale může být ve velkovýrobě problém technologický resp. energetický. Často se proto pracuje v celkovém aseptickém prostředí (vysoce čistém).
Otázky
Zamyslete se nad tím, jaké jsou fosilní a obnovitelné suroviny vedoucí ke stejným produktům.
Zkuste navrhnout selektivní činidla pro produkci bioethanolu kvasinkami.
Zamyslete se nad různými způsoby sterilizace a jejich provedení v laboratorním a provozním měřítku.
Téma 3 - Technologicky významné mikroorganismy
To nejdůležitější
Většina biotechnologicky významných organismů jsou mikroorganismy, rostliny a někteří živočichové. U posledních dvou kategorií se biotechnologie prolíná se zemědělstvím.
Řasy (mikrofyta) zahrnují taxonomicky různé fotoautotrofní mikroorganismy – sinice (kmen domény Bacteria), mikroskopické rostliny (doména Eukarya), prvoci (menší nezávislé vývojové větve domény Eukarya, obvykle získaly chloroplasty druhotně).
Doména Bacteria se dělí na 23 kmenů, většina z technologicky významných se řadí mezi Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes a Cyanobacteria.
Dělení hub na kvasinky a vláknité houby je na základě převažujícího způsobu života (jednobuněčné vers. mnohobuněčné), jsou ale známé houby, které přecházejí mezi oběma formami. Plísně nejsou taxonomická skupina, spíše technologická, obvykle s negativním dopadem.
Otázky
Popište evoluci hlavních forem života.
Zamyslete se nad evolucí fotosyntézy a vztahu k sinicím.
Zamyslete se, jaké jsou nejvýznamnější vlastnosti mikroorganismů pro biotechnologické aplikace.
Téma 4 - Metabolismus mikroorganismů
Tato kapitola je vlastně přímým pokračováním Úvodu do biochemie. Zopakujte si proto základy metabolismu – co co jsou enzymy, genetika, energetický metabolismus, základní metabolické dráhy atd.
To nejdůležitější
Energetický metabolismus a metabolismus uhlíku je třeba chápat odděleně, známe organismy např. chemoheterotrofní (získávají energie chemickou reakcí a uhlík z organických látek) i chemoautotrofní (získávají energie chemickou reakcí a uhlík z anorganických zdrojů, obvykle CO2).
Tzv. sekundární metabolismus představuje souhrn metabolických dra, které jsou „navíc“ k základním metabolickým drahám. Sekundární metabolity mohou být lecjaké povahy a jsou často předmětem biotechnologických produkcí, protože řada z nich má využití v praxi.
U biogeochemických cyklů je třeba odlišovat procesy energetické – do těch vstupuje prvek v jednom oxidačním stavu a vystupuje v jiném, a procesy asimilační, v tom případě se prvek stává součástí biomasy organismu.
Otázky
Jaké jsou podmínky pro to, aby mikroorganismus produkoval sekundární metabolit?
Zamyslete se nad biogeochemickými cykly N a S z hlediska dostupnosti jednotlivých látek v životním prostředí resp. v biotechnologických procesech.
Proč denitrifikace vyžaduje anaerobní resp. anoxické prostředí?
Zamyslete se nad hlavními rozdíly mezi metabolismem mikroorganismů a vyšších organismů.
Téma 5 - Fermentace
Tato část opět úzce navazuje na kapitoly z biochemie, zopakujte si proto především energetický metabolismus.
To nejdůležitější
Fermentace (kvašení) představují jeden z energeticky nejméně výhodných způsobů, jakým mikroorganismus může získat energii. Výhodou je, že organismus nemusí přijímat oxidační činidlo, stačí mu tedy jen jeden substrát, který se rozkládá za vzniku energeticky chudších odpadních látek. Tyto odpady představují ale pro člověka žádoucí látek, po kterých je poptávka.
Udává se např., že ethanolové kvašení je nejvýnosnější biotechnologický proces vůbec. Z pohledu kvasinek je při tom ethanol jen odpadem z glykolýzy, při které získá bídné 2 ATP.
Obvykle jsou fermentovány sacharidy, výjimečně (ale biotechnologicky málo zajímavě) i aminokyseliny, puriny nebo další látky. Jednotlivé fermentace vychází z potřeby organismu reoxidovat redukované kofaktory (NADH, FADH2), aniž by mohly využít respirační řetězce.
Termín fermentace se v biotechnologiích používá tradičně i v obecnějším významu pro procesy, které de-facto fermentační nejsou, včetně obecné kultivace. Z tohoto pochází např. termín fermentor (biologický reaktor) nebo octové kvašení (které je ve skutečnosti neúplná aerobní respirace).
Většina fermentujících organismů je schopná zároveň aerobní popř. i anaerobní respirace. A protože tyto procesy jsou energeticky výhodnější, dávají jim mikroorganismy obvykle přednost. Z tohoto důvodu je potřeba držet při biotechnologických procesech prostředí dostatečně bez kyslíku (anaerobní nebo anoxické), jinak se kvasné procesy zastaví.
Je také potřeba vzít v úvahu, že při určité koncentraci produktu se fermentační proces zastaví (na obecně platném prinicpu chemické rovnováhy) a organismus tak přijde o jediný zdroj energie a kultura obvykle uhyne. Je proto potřeba činit vhodná opatření, např. kultivovat kontinuálně, odebírat průběžně produkt apod. Typickým příkladem jsou kvasinky, u kterých se zastavuje fermentace při koncentracích kolem 15-20% alkoholu. Vyšší koncentrace je třeba dosáhnout destilací. Některé alkoholické nápoje se také vyrábějí z destilovaného lihu extrakcí.
Otázky
Popište základní fermentace z hlediska výchozích látek, produktu a významu pro produkční mikroorganismus.
Zamyslete se, jak dosáhnout nízké až nulové koncentrace kyslíku ve fermentačních procesech.
Zamyslete se, které fermentační procesy mají potenciál produkovat alternativy k produktům z ropy.Téma 6 - Rozmnožování mikroorganismů
Zopakujte si příslušné kapitoly z mikrobiologie.
To nejdůležitější
Mikroorganismy patří k dominantním aktérům biotechnologií a jejich kultivace tvoří významnou část biotechnologických procesů.
Mikroorganismy pro svůj růst a rozmnožování potřebují především živiny, klíčové jsou zdroje C, N, P, S a v některých případech minoritní látky (vitamíny, některé aminokyseliny apod.). Různé organismy umí využívat různé zdroj a tomu se přizpůsobuje i proces.
Významná je selektivita – obvykle potřebujeme kultivovat jen jednu kulturou a není žádoucí, aby byla kontaminována jinými organismy, které jsou také schopné růstu na příslušném živném médiu. Nežádoucí mikroorganismy je možné eliminovat sterilací, tak je ale ve velkém objemu energeticky náročná i technologicky problematická. Často jsou proto biotechnologické provozy provozovány v aseptickém režimu, kdy se ve výrobně udržuje vysoce čisté prostředí a pravděpodobnost kontaminace se tak eliminuje. Selekci lze také dosáhnout použitím selektivních médií. Té lze dosáhnout jednak negativně, tj. přídavkem látek, které omezují růst některých nežádoucích mikroorganismů (např. přídavkem antibiotik, ke kterým je produkční mikroorganismus rezistentní). Druhým způsobem je pozitivní selekce, kdy se část výživy realizuje takovou podobou živiny, kterou většina nežádoucích mikroorganismů neumí využít, ale produkční mikroorganismus ano (příkladem může být kultivace mikroorganismů schopných fixace vzdušného dusíku na médiu bez jiného zdroje dusíku nebo kultivace biodegradačních mikroorganismů na uhlovodících a jejich derivátech jako jediném zdroji C a energie).
Růstová křivka je závislost populace na čase po inokulaci do živného média. Jednotlivým fázím odpovídá různá fyziologie mikroorganismů, čehož se využívá i při biotechnologických procesech. V exponenciální fázi věnují mikroorganismy většinu živin a energie jen do rozmnožování a produkci biomasy, ve stacionární fázi se významná část věnuje na „konkurenční boj“, což zahrnuje mj. produkci celé řady sekundárních metabolitů.
Při kontinuální kultivaci je kultura udržována v permanentní exponenciální fázi růstu a nemůže dosáhnout stacionární fáze (z čehož mj. vyplývá, že pro většinu procesů produkujících sekundární metabolity je kontinuální kultivace nepoužitelná). Klíčové je udržet konstantní koncentraci mikroorganismů v reaktoru, prakticky to znamená, že úbytek daný odplavením části mikroorganismů musí být vykompenzován jejich nárůstem, tj. že zřeďovací rychlost se musí rovnat specifické růstové rychlosti. Ustáleného stavu lze dosáhnout dvěma hlavními způsoby. První typ, tzv. turbidistat, je průtočný reaktor, který průběžně měří koncentraci mikroorganismů (obvykle turbidimetricky, tj. úrovní zákalu, odtud název) a tomu automaticky přizpůsobuje nátok. Druhý typ, tzv. chemostat, je průtočný reaktor, kdy konstantního růstu je dosahováno limitací některé z živin a nátok zůstává konstantní. Chemostat je snadněji regulovatelný a v praxi se používá častěji, byť na rozdíl od turbidistatu nedovoluje dosáhnout maximální růstové rychlosti.
Otázky
Vzpomeňte si na přednášky z mikrobiologie a projděte si různé konkurenční strategie mikroorganismů v kontextu růstové křivky a produkce sekundárních metabolitů.
Zamyslete se nad různými zdroji C a N a jejich použitelnosti jako selektivního činidla.
Bakterie Nitrosomonas europea má v exponenciální fázi generační dobu 12 hodin. Vypočítejte specifickou růstovou rychlost a minimální objem reakční nádrže, když uvažujeme nátok na čistírnu odpadních vod 5 m3/s.
Téma 7 - Genetické inženýrství
Zopakujte si strukturu DNA a párování bazí.
To nejdůležitější
Geneticky modifikovaný organismus (GMO) je dle legislativy ČR a EU (a dalších zemí, např. USA) definován tak, že nese cíleně změněnou genetickou informaci. Mezi GMO nepatří organismy s náhodnou změnou, mutanti ani vyšlechtěné a vyselektované odrůdy/plemena/mikrobiální kmeny.
Pro práci s GMO je potřeba povolení (akreditace), které se vydává pro konkrétní organismus a konkrétní způsob nakládání. Zákon zná tři režimy nakládání a to tzv. uzavřené nakládání (GMO nesmí opustit laboratoř), uvádění do životního prostředí (GMO může být schváleným postupem uváděn do životního prostředí) a uvádění do oběhu (GMO může být schváleným způsobem předáván třetím osobám).
Otázky
Zamyslete se / zapátrejte, znáte-li nějaké geneticky modifikované organismy a jaký je význam této modifikace.
Popište stručně rozdíl mezi bodovou, chromozómovou a genomovou mutací.
Vysvětlete význam restrikčních endonukleáz pro bakterie a pro genetické inženýry.
Téma 8 - Imobilizace
To nejdůležitější
Imobilizace (=znehybnění) je způsob úpravy biologického materiálu, při kterém dojde ke snížení jeho mobility. Cílem je obvykle zlepšení manipulace, snazší dávkování, ochrana biologického materiálu nebo prevence jeho ztráty (vyplavení) především při průtočných kultivacích. Speciálně se dá imobilizace využít při průtočných procesech, které nedovolují dostatečné rozmnožování mikroorganismů.
Imobilizace se provádí buď bez matrice (např. prokřižování bílkovin glutaraldehydem za vzniku větších shluků) nebo častěji s využitím vhodné matrice (materiálu), která slouží jako nosič, na / ve kterém je biologickým materiál upevněn.
Síly, které poutají materiál k matrici, mohou být jak slabé nekovalentní interakce, tak kovalentní vazba. Speciálním případem jsou tzv. enkapsulace a entrapment, kdy je biologický materiál v matrici uzavřen („uvězněn“), aniž by s ním měl nějakou vazbu.
Imobilizace přináší technologické výhody, ovšem za vyšší cenu a také s rizikem částečné ztráty biologického materiálu při vlastní imobilizaci.
Otázky
Projděte biotechnologické procesy a zamyslete se, při kterých se používá / dala by se používat imobilizace.
Zamyslete se, jakým způsobem může imobilizace přispívat ke změně fyziologie i životaschopnosti imobilizovaných mikroorganismů.
Jaké znáte matrice vhodné pro imobilizaci různých mikroorganismů a enzymů?
Téma 9 - Průmyslové mikrobní biotechnologie
To nejdůležitější
Mikroorganismy lze využít k produkci řady látek. Klíčovým problémem mikrobiálního metabolismu je jeho ekonomičnost, s výjimkou odpadů produkuje většina mikroorganismů žádoucí látky jen pro vlastní potřebu , zatímco pro biotechnologie je potřeba nadprodukce. Tu lze zajistit např. vychýlením z optimálních kultivačních podmínek, vhodnou mutací (obvykle regulačních mechanismů), odstraňováním produktů apod.
Při produkci aminokyselin jsou typicky mutovány regulační mechanismy zabraňující přebytečné syntéze. Hezký příklad je produkce kyseliny citrónové, při které se používá mutant plísně Aspergilus niger, který má díky mutaci málo aktivní enzym citrátizomerázu (2. krok citrátového cyklu). Výsledkem je hromadění kyseliny citrónové. Zároveň se tím aktivují anaplerotické reakce včetně karboxylace pyruvátu vzdušným CO2. I díky tomu je výsledná výtěžnost kyseliny citrónové vyšší než 100% vnesené glukózy v substrátu.
Otázky
Zopakujte si regulační mechanismy mikroorganismů (především regulaci operonů) a zamyslete se, pro které produkce by se jejich změna dala použít.
Zamyslete se, které potravinové doplňky (vitamíny apod.) se vyrábějí biotechnologicky a které organismy se pro to používají.
Téma 10 - Biodegradace, bioremediace, biotechnologické zneškodňování odpadů
Zopakujte si, co jsou polutanty, jaké jsou nejvýznamnější, co jsou to POP, co je to bioakumulace a čím je dána mobilita látky v životním prostředí.
To nejdůležitější
Biodegradace je biologický (metabolický) proces rozkladu látky organismem. Bioremediace je technologie, která biodegradace využívá pro čištění znečištěného životního prostředí.
Nejčastěji jsou bioremediovány látky nežádoucí v životním prostředí – polutanty.
Zdaleka největší využití mají při bioremediacích mikroorganismy, zejména bakterie a houby, částečně také rostliny (tzv. fytoremediace, často probíhají ve spolupráci s mikroorganismy).
Organismus může látku přeměnit, může jí akumulovat nebo může změnit její biologickou dostupnost a tím i toxicitu (imobilizace). Pokud organismus látku metabolicky přeměňuje, může jí mineralizovat (tj. rozložit kompletně, především na CO2 a vodu) nebo jen částečně. Organismus může látku využívat jako zdroj uhlíku a energie nebo jí může přeměňovat bez užitky jen díky širší specifitě některých enzymů (tzv. kometabolismus).
Biodegradační dráhy pro rozklad konkrétních polutantů jsou u bakterií obvykle rozděleny na tzv. horní a dolní dráhu, horní dráha rozkládá polutant na jednodušší a obvykle lépe rozpustný ve vodě, dolní dráha směřuje obvykle ke kompletní mineralizaci.
Odbourávání halogenovaných uhlovodíků je poněkud specifické, halogeny svou velikostí brání rozkladu, klíčová je tedy jejich eliminace z molekuly (dehalogenace). Ta může být oxidační, při které ale obvykle vznikají toxické meziprodukty, nebo anaerobní redukční, která je naopak pro mikroorganismus energeticky výhodná.
Biologická dostupnost představuje označení pro stav polutantu (podíl polutantu), který je v daných podmínkách konkrétním organismem metabolizovatelný.
Pro znečišťování odpadů se nejvíce využívají procesy kompostování (aerobní rozklad), produkce bioplynu (anaerobní rozklad za vzniku směsi methanu a CO2). Některé odpady je možné využít i jako zdroj uhlíku a energie popř. dalších živin pro některé biotechnologické procesy.
Otázky
Zamyslete se, které faktory ovlivňují biologickou dostupnost látky v prostředí (především v půdě).
Jaké mikroorganismy (z hlediska metabolického) byste použili na bioremediaci tetrachlorethylenu resp. ropných látek?
Vysvětlete na příkladech, co je to kometabolismus.
Téma 11 - Biometalurgie, biopaliva
To nejdůležitější
Některé organismy je možné využít pro získávání kovů z rud, odpadů nebo roztoků. Především jde o tyto skupiny organismů:
· Síru oxidující bakterie (aerobní), které mají schopnost oxidovat i málorozpustné sulfidy kovů – rudy popř. i kovové odpady. |Produkují kyselinu sírovou, která přispívá k rozpouštění kovů.
· Řada mikroorganismů (především bakterií) popř. řas schopných akumulovat kovy z roztoku ve své biomase.
· Řada mikroorganismů (především bakterií), které mají schopnost sorbovat kovy na svém povrchu, často i v podobě mrtvé biomasy.
· Rostliny schopné akumulovat kovy ve své biomase, především tzv. hyperakumulátory.
Biopaliva jsou biologické produkty transformované na paliva pro spalovací motory. Jde především o bioethanol použitelný jako příměs do benzínu, estery mastných kyselin jako náhrada nafty a bioplyn. Dělí se na 4 generace:
1. generace produkovaná ze zemědělských plodin na zemědělské půdě, obvykle náročná na hnojené, aplikaci pesticidů, obdělávání půdy apod., trvale neudržitelná. Dosud se používá nejvíce, strategie EU předpokládají její utlumení a přechod na vyšší generace.
2. generace produkovaná především z trvalých travních porostů nebo rychle rostoucích dřevin popř. z odpadů. Vyžaduje méně péče a má obvykle dobrý dopad na kvalitu půdy. Zatím nemá takovou produkci, řada aspektů není úplně technologicky dořešená.
3. generace produkovaná především s využitím autotrofních mikroorganismů (řasy, sinice). Některé akumulují lipidy, jiné sacharidy, některé sinice jsou schopné produkovat plynný vodík. Ve světě jsou experimentální plné provozy.
4. generace využívající geneticky modifikovaných organismů, zatím spíše ve fázi laboratorních výzkumů.
Otázky
Zamyslete se nad složením kovového odpadu a jeho případné rozpustitelnosti pomocí mikroorganismů.
Zopakujte si povrchové vlastnosti mikroorganismů a jejich možnosti sorbovat ionty kovů z roztoku.
Zamyslete se nad možnostmi / potenciálem produkce biopaliv vyšší generace u nás
Téma 12 - Výrobní zařízení pro biotechnologie
To nejdůležitější
Biotechnologické provozy vyžadují speciální zařízení, tradičně nazývané fermentory (i když se v nich nerealizují fermentace). Ty lze klasifikovat podle řady kritérií, především na vsádkové, fed-batch a průtočné. Klíčové faktory jsou separace produktu od biologického materiálu, aerace / udržení anaerobního prostředí, regulace, míchání, sterilace a čištění.
Kultivace mikroorganismů probíhá obvykle emerzně (mikroorganismy na povrchu, typické pro houby a některé bakterie a kvasinky) nebo submerzně, kdy jsou mikroorganismy u dna (typické pro kvasinky Saccaromyces cerevisiae při kvašení piva a vína).
Otázky
Zamyslete se u jednotlivých produkčních / rozkladných biotechnologických procesů nad jejich technologickým pozadím – jaké reaktory, zda se aeruje a jak, jak se míchají apod.
Téma 13 - Živočišné a rostlinné biotechnologie
To nejdůležitější
Vyšší organismy (živočichové, rostliny) mají v biotechnologiích použití především jako celé. Nicméně se rozvíjejí technologie, kdy jsou používané jen buněčné / tkáňové kultury (tzv. in vitro kultury). Výhodou je možnost měnit fyziologii buněk a produkovat řadu metabolitů jinak obtížně dostupných (např. protilátky, interferony, rostlinné hormony apod.).
Klíčovým problémem je, že na rozdíl od mikroorganismů, se buňky mnohobuněčných organismů nechovají individuálně, ale spíše masově a podřízeně potřebám celého organismu a také jsou na něm závislé. Obvykle vyžadují řadu růstových faktorů (hormonů, vitamínu, speciálních živin apod.), často podklad (typické pro živočišné kultury) a také překonání bariéry nesamostatného růstu (toho lze dosáhnout např. konjugací s nádorovými buňkami). Problémem je také sterilita, protože tkáňové kultury rostou velmi pomalu v prostředí vhodném pro růst mikroorganismů a v případě sebemenší kontaminace mikroorganismy tkáňovou kulturu nemilosrdně přerostou a znehodnotí.
Otázky
Zamyslete se nad tím, které látky by se daly vhodně produkovat živočišnými / rostlinnými kulturami.
Téma 14 - Enzymové inženýrství
Zopakujte si, co jsou enzymy a jak jsou produkovány. Co je to extracelulární metabolismus a jaký je jeho ekologický význam.
To nejdůležitější
Enzymy mají v praxi bohaté použití – masově např. jako přídavek do pracích prášků, v potravinářství, v řadě dalších biotechnologických výrobách, ve výzkumu, ve farmacii atd.
Vhodnými producenty jsou především bakterie a houby, řada enzymů je při tom produkována extracelulárně, takže jejich izolace je poměrně snadná. Produkční kmeny se často vybírají podle své odolnosti, významné jsou především termofilní mikroorganismy, jejichž enzymy jsou odolné k vysokým teplotám a jsou aktivní např. i při vyšších teplotách praní.
Otázky
Zamyslete se, v kterých výrobcích každodenního života / technologické praxe jsou použity enzymy a jaký je jejich význam ve výrobku.
Téma 15 - Bioanalytické postupy
Bioanalytické postupy rozšiřují klasické postupy analytické chemie. Hlavní výhodou použití biologického materiálu je jeho specifita a selektivita – enzym rozpoznává jen „svůj“ substrát v řadě jemu podobných a odlišuje i enantiomery, protilátka váže jen „svůj“ antigen i ve směsi mnoha dalších antigenů, receptor váže pro něj určený hormon apod.
Vlastní uspořádání obvykle vychází ze zavedených analytických postupů a vhodně ho rozšiřuje, např. bioafinitní chromatografie využívá protilátky nebo enzymy k selektivní separaci analytu, elektrody modifikované enzymy zajišťují selektivitu odezvy apod.
Bioassay je analytická procedura využívající částečně biologický materiál. Obvykle vyžaduje alespoň částečně vyškolený personál (laboranta) a obvyklou laboratorní instrumentaci („smíchejte činidlo A s analytem, protřepejte, počkejte, odstřeďte a změřte absorbanci při xxx nm“). V jednoduché podobě sem lze zařadit i např. papírkové indikátory (těhotenský test, test na glukózu v moči apod.). Biosenzor je oproti tomu zařízení v podstatě samostatné, školenou obsluhu nevyžadující, připojené na záznamové zařízení nebo display, do kterého stačí vložit analyt a samo dá odpověď. Typickým příkladem je glukometr.
Otázky
Zamyslete se nad tím, pro které běžné analyty je možné využít bioassay a biosenzor. Znáte nějaký z běžného života?
Základy biochemie technologických procesů II. - skripta